细胞凋亡过程通常伴随着显著的细胞形态学变化。例如，在细胞凋亡的早期，质膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)会翻转到细胞膜的外侧；而在凋亡的中后期，随着细胞膜通透性的增加，一些大型分子化合物如碘化丙啶(PI)能够自由扩散进入细胞，从而使细胞核被染成红色荧光。

Annexin V/PI 检测法原理
Annexin V 是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，具有对磷脂酰丝氨酸的高亲和力和特异性结合能力。由于其无法穿透完整的细胞膜，早期凋亡细胞的细胞膜保持完整，因此对碘化丙啶(PI)具备拒染性。然而，在细胞凋亡后期及死亡细胞中，PI能够顺利穿透细胞膜，从而使细胞核被染色。因此，结合使用Annexin V 和 PI，可以有效区分早期凋亡细胞与其他细胞。

Annexin V/PI 凋亡检测推荐（尊龙凯时）
[名称] 流式凋亡检测试剂盒
[货号] AC12L033
[规格] 100T

操作步骤

▶ 对照管的设置：
1. 空白管：诱导凋亡的细胞不加染料，用于调节电压；
2. 单染管：分别只加 PI 和荧光标记的 Annexin V 两个单染管，用于调节补偿；
3. 实验管：诱导凋亡的细胞加入本次实验的所有荧光染料；
4. 阴性管：正常培养的细胞加入染料，以确认细胞的正常状态，排除假阳性。

▶ 悬浮细胞收集染色：
1. 经过细胞凋亡刺激后，离心5分钟，去除上清，收集细胞并用 PBS 轻轻重悬细胞并计数；
2. 取 1~5×10^5 重悬的细胞，离心5分钟，去除上清，加入500µl结合液轻轻重悬细胞；
3. 加入 5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入 5μL 碘化丙啶，轻轻混匀；
4. 室温避光孵育 10 分钟，可使用铝箔避免光照；
5. 随即进行流式细胞仪检测，其中 Annexin V-FITC 显示绿色荧光，而 PI 显示红色荧光。

▶ 贴壁细胞收集染色：
1. 把细胞培养液吸出至合适的离心管，使用 PBS 洗涤贴壁细胞一次，再用胰酶细胞消化液(最好不使用含有 EDTA 的消化液)消化细胞；
2. 细胞消化后，按照悬浮细胞的操作步骤进行。

▶ 上机检测：
在染色孵育后，立即进行流式细胞仪检测或荧光显微镜检测。

Annexin V/PI 检测法注意事项

• 检测贴壁细胞时，如果难以控制消化时间，建议使用 Accutase 细胞消化液，这种液体对细胞的损伤小，且不会改变细胞膜上 PS 的分布；
• 选择 Annexin V 荧光染料时需考虑细胞的自发荧光，特别是培养时间久或药物处理的细胞，需注意细胞代谢物的荧光干扰；
• 染色完成后，请勿固定细胞，尽快进行检测，可以将检测管放在冰上以减少环境对结果的影响；
• 进行凋亡统计时，一般只统计早期凋亡的比例，因为只有早期凋亡细胞的统计才具有意义。当然，文献中也可能统计总的凋亡比例（早期与晚期凋亡之和），但单纯统计晚期凋亡的意义不大。